一、目的要求

1、了解并掌握培養(yǎng)基的配制、分裝方法

2、掌握各種實驗室滅菌方法及技術(shù)

二、基本原理

培養(yǎng)基是供微生物生長、繁殖、代謝的混合養(yǎng)料。由于微生物具有不同的營養(yǎng)類型，對營養(yǎng)物質(zhì)的要求也各不相同，加之實驗和研究的目的不同，所以培養(yǎng)基的種類很多，使用的原料也各有差異，但從營養(yǎng)角度分析，培養(yǎng)基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、無機鹽、生長素以及水分等。另外，培養(yǎng)基還應具有適宜的pH值、一定的緩沖能力、一定的氧化還原電位及合適的滲透壓。
瓊脂是從石花菜等海藻中提取的膠體物質(zhì)，是應用zui廣的凝固劑。加瓊脂制成的培養(yǎng)基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反復融化，其凝固性降低。
任何一種培養(yǎng)基一經(jīng)制成就應及時*滅菌，以備純培養(yǎng)用。一般培養(yǎng)基的滅菌采用高壓蒸汽滅菌。

三、器材

1、溶液或試劑  蛋白胨、NaCl、K2HPO4、瓊脂、NaNO3、KCl、MgSO4、FeSO4等等見培養(yǎng)基配方。

2、儀器或其他用具  電子天平、高壓蒸汽滅菌鍋、稱量紙、牛角匙、精密pH試紙、量筒、刻度搪瓷杯、試管、三角瓶、漏斗、分裝架、移液管及移液管筒、培養(yǎng)皿、玻璃棒、燒杯、試管架、酒精燈、電爐等。

四、操作步驟

基本流程：稱藥品→溶解→調(diào)pH值→融化瓊脂→過濾分裝→包扎標記→滅菌→擺斜面或倒平板。

1、 稱量藥品

根據(jù)培養(yǎng)基配方及配制量依次準確稱取各種藥品，放入適當大小的燒杯中，瓊脂不要加入。蛋白胨極易吸潮，故稱量時要迅速。

2、溶解
用量筒取一定量（約占總量的2/3）蒸餾水倒入燒杯中，在電爐上小火加熱，并用玻棒攪拌，以防液體溢出。待各種藥品*溶解后，停止加熱，補足水分。如果配方中有淀粉，則先將淀粉用少量冷水調(diào)成糊狀，并在火上加熱攪拌，然后加足水分及其它原料，待*溶化后，補足水分。

3、調(diào)節(jié)pH
根據(jù)培養(yǎng)基對pH的要求，用5%NaOH或5%HC1溶液調(diào)至所需pH。測定pH可用pH試紙或酸度計等。

4、溶化瓊脂
      固體或半固體培養(yǎng)基須加入一定量瓊脂。瓊脂加入后，置電爐上一面攪拌一面加熱，直至瓊脂*融化后才能停止攪拌，并補足水分（水需預熱）。注意控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。

5、分裝
分裝時注意不要使培養(yǎng)基沾染在管口或瓶口，以免引起污染。液體分裝高度以試管高度的1/4左右為宜。固體分裝裝量為管高的1/5，半固體分裝試管一般以試管高度的1/3為宜；分裝三角瓶，其裝量以不超過三角瓶容積的2/3為宜。

6、包扎標記
培養(yǎng)基分裝后加好硅膠塞或試管帽。在在瓶壁或管壁上標明培養(yǎng)基名稱，制備組別和姓名、日期等。

7、滅菌

培養(yǎng)基應按培養(yǎng)基配方中規(guī)定的條件及時進行滅菌。普通培養(yǎng)基為121℃ 20min，以保證滅菌效果和不損傷培養(yǎng)基的有效成份。培養(yǎng)基經(jīng)滅菌后，如需要作斜面固體培養(yǎng)基，則滅菌后立即擺放成斜面，斜面長度一般以不超過試管長度的1/2為宜。

7.1高壓蒸汽滅菌法
高壓蒸汽滅菌用途廣，效率高，是微生物學實驗中zui常用的滅菌方法。這種滅菌方法是基于水的沸點隨著蒸汽壓力的升高而升高的原理設計的。當蒸汽壓力達到1.05kg/cm2時，水蒸氣的溫度升高到121℃，經(jīng)15～30min，可全部殺死鍋內(nèi)物品上的各種微生物和它們的孢子或芽孢。一般培養(yǎng)基、玻璃器皿以及傳染性標本和工作服等都可應用此法滅菌

7.2操作方法和注意事項如下 :
7.2.1  加水
打開滅菌鍋蓋，向鍋內(nèi)加水到水位線。立式消毒鍋用已煮開過的水，以便減少水垢在鍋內(nèi)的積存。注意水要加夠，防止滅菌過程中干鍋。
7.2.2  裝料、加蓋
滅菌材料放好后，關閉滅菌器蓋，使蒸汽鍋密閉，勿使漏氣。
7.2.3  排氣                                     

打開排氣口（也叫放氣閥）。分別設定所需滅菌溫度和時間（鍋體上的定時器為一壓控開關）。接通電源加熱，待水煮沸后，水蒸氣和空氣一起從排氣孔排出，當有大量蒸汽排出時，維持5min，使鍋內(nèi)冷空氣*排凈。
7.2.4  升壓、保壓和降壓
當鍋內(nèi)冷空氣排凈時，即可關閉排氣閥，壓力開始上升。當壓力上升至所需壓力時，滅菌鍋自動控制加熱開關以維持恒溫，待設定時間到達（一般培養(yǎng)基和器皿滅菌控制在121℃，20min）后，自動停止加熱，待壓力降至接近“0”時，打開放氣閥。注意不能過早過急地排氣，否則會由于瓶內(nèi)壓力下降的速度比鍋內(nèi)慢而造成瓶內(nèi)液體沖出容器之外。

8、無菌檢查

將已滅菌培養(yǎng)基放入37℃的溫室中培養(yǎng)24~48小時，以檢查滅菌是否*。

本實驗分離用培養(yǎng)基的配方:

A．1/5NB培養(yǎng)基（各成分取1/5）

    營養(yǎng)肉湯（nutrient broth）培養(yǎng)基（1L）：

牛肉膏（beef extract）             3g /l；

蛋白胨 （soy peptone）              5g /l；

pH 7.0

B．喹啉降解菌分離用培養(yǎng)基     單位    g/L

Na2HPO4                             1.6

KH2PO4                              1.0

NH4Cl                               0.5

K2SO4                                  0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配制時每一成分逐一溶化，否則會產(chǎn)生沉淀。

以喹啉作為*碳源時，喹啉的加入量為0.5～2 mmol/L（或40ul/L～150ul/L）。對于固體培養(yǎng)基，喹啉的加入量為每塊平板2ul～10ul喹啉（置于培養(yǎng)基表面）。

*喹啉要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

C．反硝化富集培養(yǎng)基   單位  g/L

Na2HPO4                              1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                          0.025

MgCl2·6 H2O                          0.1

NaHCO3                                     0.42

EDTA·Na2                             0.015

FeSO4·7H2O                           0.0015

D-BIOTIN                              0.010

KNO3                                        0.505

乙酸鈉                                 1

酒石酸鈉鉀                             2

   * 喹啉（苯酚）                           40ul（300mg） 

配制時每一成分逐一溶化，否則會產(chǎn)生沉淀。 

*喹啉（苯酚）要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

D. 1/10TSA（Tryptic soy agar）培養(yǎng)基（各成分取/10）：

胰蛋白胨                   15 g/l,

大豆胨 （Soytone）          5 g/l,

NaCl                       5 g/l,

瓊脂                       15 g/l

E．苯酚降解菌分離用培養(yǎng)基     單位    g/L

Na2HPO4                               1.6

KH2PO4                               1.0

NH4Cl                                0.5

K2SO4                                   0.06

CaCl2·2 H2O                         0.025

MgCl2·6 H2O                         0.1

NaHCO3                                 0.42

EDTA·Na2                            0.015

FeSO4·7H2O                          0.0015

D-BIOTIN                             0.010

KNO3                                     0.505

配制時每一成分逐一溶化，否則會產(chǎn)生沉淀。

以苯酚作為*碳源時，苯酚的加入量為200～800 mg/L。

苯酚要在培養(yǎng)基滅菌后加入

制備固體分離培養(yǎng)基時需加入1.5g agar/100ml培養(yǎng)基。

F．R2A培養(yǎng)基

酵母提取物                 0.50 g /l

胰蛋白胨                   0.25 g /l

大豆胨 （Soytone）         0.25 g/l,

酸水解酪素                 0.50 g /l

葡萄糖                     0.50 g/l

可溶淀粉                   0.50 g /l

丙酮酸鈉                   0.30 g/l

K2H PO4                       0.30 g/l

 MgSO4·7H2O               0.05 g/l

瓊脂                       15.00 g /l

在加入瓊脂前用結(jié)晶的磷酸氫鉀或磷酸二氫鉀調(diào)整zui終PH值為7.2。加入瓊脂后，加熱培養(yǎng)基使其沸騰，瓊脂溶解后在121℃高壓滅菌15分鐘。

 LB液體培養(yǎng)基配方

       蛋白胨    10g

       酵母粉     5g

       NaCl       10g

       H2O          1000ml

       pH7.2